【原理】 对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是指在适宜缓冲液和电场条件下,抗原和相应抗体在琼脂凝胶中,由于电泳和电渗作用抗原,抗原向正极移动,抗体向负极移动。将抗原放负极端,抗体放正极端,则抗原抗体相向移动,在两孔之间相遇,在比例合适时形成沉淀线。以Sm和RNP(核糖核蛋白)等可提取性抗原(extractablenucleatantigen,ENA)检测相应抗Sm和RNP为例。 【材料】 1.Sm/RNP抗原制备将新鲜或冻存于-30℃的小牛胸腺除去脂肪与结缔组织后,用0.004mol/L氯化钙-0.28mol/L蔗糖溶液洗净,切碎。每50g胸腺加上述含钙0.28mol/L蔗糖450ml。于匀浆器中慢档(约8000r/min)匀浆2~3min(速度过高,核可能破坏)。两层纱布过滤,滤液1500r/min离心20min,弃上清液(胞浆成分)。沉淀(核)用0.004mol/L氯化钙-0.25mol/L蔗糖洗1次。用50mlpH7.10.1mol/LPBS(或pH7.20.01mol/LPBS)将沉淀物悬起,于匀浆器中快档匀浆2~3min,使核破碎。4℃过夜后用纱布滤除不溶性物质,滤液以30000g4℃离心1h除去沉淀物。上清液按10mg/ml比例加入醋酸钠干粉,缓慢搅拌至溶。加入6倍体积的无水乙醇,发生絮片状沉淀,10min后1500r/min离心10min。弃上清液,沉淀中加入生理盐水20ml,使大部分溶解,1500r/min,弃沉淀。上清液对蒸馏水透析后分装,冷冻干燥保存。 2.待检血清和已知抗ENA阳性血清。 3.PH8.60.05mol/L巴比妥缓冲液。 4.琼脂、载玻片、吸管、毛细滴管、打孔器、电泳仪、电泳槽、万用表、适量滤纸或纱布。 【方法】 1.制备1.2%巴比妥缓冲琼脂凝胶板先用生理盐水50ml加1.2g琼脂隔水煮沸融化,再加50mlpH8.60.05mol/L巴比妥缓冲液继续隔水煮沸至澄清,取融化的琼脂3.5~4ml,浇于载玻片上,冷却后打孔。 2.打孔用打孔器(或用绘图笔尖)成对打孔,孔径3mm,孔距6mm。 3.打样先于阳极侧孔内加待检血清或阳性对照血清,10V/cm电压,电泳30min(时间可随具体实验条件加以调整),再于阴极侧孔内加ENA抗原(巴比妥缓冲液溶解的),继续电泳约45min。 4.待阳性对照血清孔与ENA抗原孔之间出现白色沉淀线时停止电泳。 5.初步观察后,将凝胶板置湿盒继续扩散24h。 【结果】 判定结果时,待检血清如含抗RNP与抗Sm两种抗体则在与ENA抗原孔之间出现两条沉淀线,靠近阴极侧的沉淀线由抗Sm与相应抗原形成,靠近阳极侧的沉淀线则由抗RNP与相应抗原形成。如只出现一条沉淀线,则须与阳性对照血清参比,以判定其性质。由于Sm抗原可耐56℃ 1h,RNP则遭破坏,故也可将ENA抗原加热处理后再与待测血清作对流免疫电泳。 对流免疫电泳简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高8~16倍(如测AFP敏感度为2.5~5.0μg/ml),但分辨力低于双向琼脂扩散。 注意事项 本方法以高电渗为其特点之一,但电渗作用过强会使多数蛋白质向阴极移动,因此不宜使用电渗作用过强的琼脂。如果抗原也是免疫球蛋白,或抗原抗体的扩散率比较接近,会导致电泳时抗原和抗体向一个方向移动,不能形成对流效应,这种情况下不宜做对流免疫电泳。